2022燕窝展|上海燕博会|12月滋补品展谈燕窝多肽的抗氧化活性研究及理化性质分析

 

自由基是细胞的正常代谢产物。正常情况下，自由基的产生和清除处于平衡状态。当自由基产生过多或机体的氧化还原系统失衡时，大量的自由基会损伤细胞的核酸、蛋白质以及脂质等结构，诱导细胞自噬，引发细胞凋亡，严重时甚至会引起各种年龄依赖性疾病，包括癌症、心血管疾病、关节炎和阿尔兹海默症等。因此寻找能够有效清除自由基的天然抗氧化药物成为了研究热点。蒋林团队通过三种自由基清除实验进一步评估了燕窝多肽的抗氧化活性，并利用MALDI-TOF-MS、紫外光谱、红外光谱等对燕窝多肽的理化性质进行研究，分析其产生抗氧化活性的成因，旨在为燕碎（粉）资源的高值化利用提供科学依据。

被誉为世界滋补行业盛会的世界燕窝及天然滋补品展览会简称上海燕博会许洋，张娟一八六零一六八一八五八定于2022年12月1-3日在上海新国际博览中心隆重召开，将有超过+500家品牌企业参展，横跨涉及干燕窝、鲜炖燕窝、即食燕窝、冻干燕窝、燕窝粥、燕窝月饼、燕窝粽子、燕窝饮品等衍生品、即食鱼胶等花胶产品、燕窝化妆品、酵素、虫草、海参、鱼胶、枸杞、陈皮、阿胶、参茸、海马、羊肚菌、益生菌、花胶鸡、佛跳墙、鱼翅、西洋参、藏红花、蜂蜜、雪蛤油、药食同源、营养健康食品、滋补饮品、源头工厂、供应原材料、相关设备、生产商以及印刷、包装、销售、培训、互联网等多个领域，既覆盖了营养健康圈产业链上的各生产环节，也交叉跨界到与消费有关的其他领域。

1、燕窝多肽与酶解

燕窝多肽（PFC）通过酶解工艺优化后获得，FC系未被酶解的燕窝。

Jie Cao, Ning Xiong, Yu Zhang, Yuwei Dai, Yuye Wang, Lingyu Lu and Lin Jiang*. Using RSM for optimum of optimum production of peptides from edible bird's nest by-product and characterization of its antioxidant's properties[J]. Foods, 2022, 11: 859-877

2、燕窝多肽（PFC）的体外抗氧化活性

（1）DPPH自由基清除活性

不同浓度的Vc和PFC对DPPH自由基的清除活性结果如图3-1（a）所示。PFC在0 ~ 5 mg/mL浓度下对DPPH自由基有明显的清除作用，且呈浓度依赖性，其IC50为2.51 mg/mL。当浓度为5 mg/mL时，PFC的DPPH自由基的清除率最高，为86.44%。

（2）ABTS自由基清除活性

不同浓度的Vc和PFC对ABTS自由基的清除活性结果如图3-1（b）所示。由图3-1（b）可知，在0 ~ 5mg/mL的范围内，PFC清除率随浓度的增加而增加，IC50为2.21 mg/mL。当浓度为5 mg/mL时，PFC清除率达到，为70.16%。

（3）O2-自由基清除活性

PFC与Vc对O2-自由基的清除能力如图3-1（c）所示，PFC在0 ~ 3 mg/mL范围内对O2-自由基的清除能力随PFC的增加而增强，当浓度大于3 mg/mL时，PFC对O2-自由基清除能力趋于平缓。但PFC的O2-自由基IC50比DPPH、ABTS自由基低，为1.67 mg/mL。在5 mg/mL时，PFC的O2-自由基清除率为58.44%，这说明PFC清除O2-自由基的能力较弱。

2、燕窝多肽（PFC）的分子量分布

根据不同蛋白水解产物的多肽分子量分布（聚丙烯酰胺凝胶电泳法）可知，中性蛋白酶酶解产物的分子量小于14.4 kDa。因此，为进一步确定PFC的分子量分布，采用MALDI-TOF-MS测定PFC的分子量。如图3-2所示，PFC的分子量主要分布在3 kDa以下，且在1 kDa分子量附近的吸收强度较大。这表明PFC中主要存在的是＜3 kDa的多肽。

3、紫外光谱分析

如图3-3所示，由于酰胺键和苯丙氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸的存在使得燕窝多肽（PFC）和未被酶解的燕碎（FC）在225 nm和PFC 280 nm中产生紫外吸收峰。根据朗伯比尔定律，浓度越大，吸光度越大，PEC的吸光度大于FC，说明PFC中的多肽含量更高，酶解破坏了蛋白质的结构，促进了生物活性肽的释放。

4、红外光谱分析

如图3-4所示，PFC和FC在3300 ~ 3400 cm-1处有一个宽峰，属于酰胺A带（3000 ~ 3500 cm-1），由N-H和O-H伸缩振动引起的，通常会形成氢键，稳定蛋白和多肽的二级结构。2960 cm-1的吸收峰是由C-H非对称伸缩振动引起的，属于酰胺B带。酰胺 Ⅰ带可用于预测蛋白质的二级结构，其波长范围在1600 ~ 1670 cm-1之间，由C-O双键间的伸缩振动引起。多肽通常在1600 ~ 1640 cm-1的吸收峰为β-折叠，在1650 ~ 1660 cm-1为α-螺旋结构。PFC和FC的吸收峰分别为1640 cm-1和1650 cm-1，表明FC的结构为为α-螺旋，PFC为α-折叠结构。二者蛋白结构不一致可能是因为酶解破坏蛋白质的结构，使得吸收峰红移。由于蛋白酶的作用将大分子蛋白质变为多肽，导致PFC在1550 cm-1处没有酰胺 Ⅱ 带的特征吸收。此外，酶解后 -COOH含量的增多使PFC在1410 cm-1处的羰基伸缩振动峰性变尖。最后，两者都在1070 cm-1左右有一个酰胺 Ⅲ 带。综上所述，PFC和FC的红外光谱图基本一致，说明酶解在一定程度上会改变峰的位置强度和面积，但是不会出现新的官能团。这与酶解作用使蛋白质的二级结构发生一定变化，改变蛋白质构象比例的结论相一致。

5、X-射线粉末衍射分析

X-射线粉末衍射的吸收越强，则结晶性越强，反之则越弱。从图3-5中可以看出，FC在2θ为20°时存在较宽衍射峰，结晶度较低，为无定形结构。PFC在2θ为10°、31.8°和45.37°处有较大的吸收峰，10°左右的衍射峰较宽，31.8°和45.37°的衍射峰较窄，说明PFC中存在较强结晶。这可能是因为酶解过程中，大分子蛋白质发生了重排和聚集，疏水性氨基酸生成的增多形成了结构更加稳定的小分子肽晶体。

6、扫描电镜分析

PFC和FC的表面形态结果如图3-6所示。PFC和FC的微观结构存在一定差异。FC表面完整度较高，且较为平整，呈致密的片状结构。PFC表面的平整度下降，断裂成小碎片。相比较FC，PFC的表面凹凸不平，疏松多孔。这可能是因为酶解作用破坏了蛋白质分子间的氢键和范德华力，导致蛋白粒径减小，分子间交联作用减弱，出现疏松多孔的小片状结构。

7、总结

通过DPPH、ABTS以及O2-自由基清除实验初步评估燕窝多肽（PFC）的抗氧化活性。结果发现，三种自由基清除活性随PFC浓度的增加而增加，但它们的清除活性仍低于相同浓度的Vc。PFC清除DPPH自由基的IC50值为2.51 mg/mL，远低于从泥鳅蛋白水解物中分离出的单体肽PSYV的IC50（17.0 mg/mL）。PFC清除ABTS自由基的IC50值为2.21 mg/mL，与盛周煌等报道的罗非鱼皮胶原蛋白多肽的IC50接近。另外，其O2-自由基的IC50值为1.67 mg/mL，远优于从鱼鳔中分离得到的单体肽YLPYA的IC50（3.61 mg/mL）。姜惠敏等认为天然活性物质的IC50值低于10 mg/mL具有良好的抗氧化活性。由此可见，PFC具有较强的抗氧化活性。

利用MALDI-TOF-MS、紫外光谱和红外光谱等方法对PFC的理化性质进行分析。结果发现，PFC的分子量主要集中在3 kDa以下。研究表明，分子量较小的多肽比分子量大的多肽更容易与自由基结合，自由基清除能力更强。因此，富含小分子量的多肽可能是PFC具有良好抗氧化活性的原因之一。PFC在200 ~ 220 nm和280 nm均存在紫外吸收，表明了其存在酰胺键和芳香性氨基酸，其中芳香性氨基酸的存在有助于增强抗氧化活性。PFC的FT-IR图谱表明该多肽保留了源蛋白的官能团结构，酶解产物PFC中β-折叠结构较多，可提高PFC的自由基清除能力。X-射线粉末衍射和扫描电镜的结果都说明了酶解会破坏蛋白质的结构，在降解过程中可能导致更多疏水性基团的暴露，进而增强PFC的抗氧化活性。综上所述，小分子量的低聚肽、疏水性氨基酸和特殊的微观形貌和空间结构赋予PFC良好的抗氧化活性。本实验的结果为进一步研究燕窝的药理作用奠定了基础。

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